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簡述大鼠肝微粒體的制備方法

更新時間:2022-09-01  |  點擊率:1768
  肝臟是藥物的主要代謝器官,富含參與藥物的一相代謝和二相代謝的混合功能氧化酶系統(tǒng),其中90%藥物主要是由細胞色素P450酶參與進行生物轉(zhuǎn)化。采用從肝臟或腸提取的微粒體,加入還原型輔酶Ⅱ(NADPH)再生系統(tǒng),在體外模擬生理環(huán)境下進行代謝反應,采用高效液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法等測定方法對原性藥及代謝產(chǎn)物進行測定,其中肝微粒體法較為常見。
 
  大鼠肝微粒體是肝、腸、腎等器官經(jīng)過差速離心制備的亞細胞成分,是細胞器內(nèi)質(zhì)網(wǎng)一部分,該部分表達有種類多樣的蛋白質(zhì)。具有完整的I相代謝酶(如細胞色素P450、黃素單加氧酶、單胺氧化酶等),II相代謝酶(如葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)移酶,硫酸基轉(zhuǎn)移酶)、酯酶等,能體現(xiàn)絕大部分人體內(nèi)藥物代謝的情況,是FDA指導原則的預測人體內(nèi)代謝及抑制試驗的研究工具。
 
  下面小編要與大家分享的是大鼠肝微粒體的制備方法:
 
  1、購買實驗動物SD大鼠,20只,雌雄各半,體重(180-220)g。
 
  2、大鼠肝臟灌流,購買的大鼠當天腹腔注射3%(30mg?kg-1),使其麻醉,利用酒精進行常規(guī)消毒后,打開腹腔暴露肝臟,肝門靜脈處進行插管并固定。結(jié)扎上腔靜脈,剪破下腔靜脈用磷酸鹽緩沖液進行灌流,直至肝臟顏色呈土黃色。
 
  3、灌流好的肝臟取出后按1:4比例放入裝有磷酸鹽緩沖液(含1mMEDTA,0.25M蔗糖)的勻漿管內(nèi),剪碎、勻漿。
 
  4、將勻漿液倒入50mL高速離心管中在4℃條件下9000g離心20min。
 
  5、保留上清并轉(zhuǎn)移到超速離心管中,在4℃條件下100000g離心60min。
 
  6、保留沉淀并重新混懸于磷酸鹽緩沖液(含0.9%的NaCL)中,4℃條件下100000g再離心60min,得到的沉淀即為肝微粒體。
 
  7、將其重懸于0.1M磷酸緩沖液(PH7.4,20%甘油,1mMEDTA,0.25M蔗糖)中于-70℃冰箱保存,其中留取一小管用于蛋白濃度測定。
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